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        8項工程菌高密度發酵工藝開發策略

        日期:2020-07-22 作者:發酵罐專業生產商上海聯環生物 閱讀:214

        利用重組DNA技術獲取的生物藥物在人類文明史上具有劃時代的意義。許多價值高產量低的功能蛋白如干擾素、白細胞介素、集落刺激因子、生長激素、胰島素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中獲得了高效率表達。由于工程菌高密度培養能夠提高單位體積的產量,在工業生產上可以提高效率降低成本。所以,高密度培養一直都是發酵工程師們所追捧的熱點。本文就工程大腸桿菌高密度發酵工藝開發中涉及的關鍵控制點加以探討。
        穩定可靠的菌種是工業化大生產的有力保障,直接關系到生產效率和成本高低。不同于傳統誘變育種模式,在對待工程菌菌種問題上,有人認為基因工程菌種構建完成后無需經過嚴格單克隆篩選,既節約時間成本又大大減少了工作量,這其實是一個認識誤區。這樣做出來的菌種很難連續穩定傳代50次以上,給中試放大以及后續的長期穩定生產留下了隱患。業內一般以能否穩定遺傳50代作為判斷工程菌種優劣的一個標準。
        發酵所需的接種量不是越大越好,要適當。接種量過小導致適應期過長,菌種易提前老化,也增加了雜菌污染的風險。接種量過大會過早引起溶氧不足,導致發酵失控。且營養物質消耗過快也會影響后期正常生長。一般大腸桿菌接種量遵循逐級增大的原則,并將最后一級的放大倍數控制在10倍左右。
        種子培養一定要在最佳條件下進行,培養時間不宜過長,當種子生長至最佳狀態時果斷移種。如果種子做的不好,其負面影響往往在發酵中后期會有所體現。工程菌種培養會加入抗生素,不僅是為了抑制雜菌生長,更重要的是為了給菌種形成正向的抗性篩選壓力,及時淘汰質粒丟失的菌株或者衰老的菌體,保證質粒攜帶菌群的正常生長與表達。
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        除了必須的碳源以外,有機復合氮源在蛋白表達階段不可或缺。有機復合氮源可提供豐富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、維生素、生物素以及一些生物活性物質,能減輕細胞代謝負擔,促進外源蛋白表達。如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加時,存在一種非常有趣的代謝機制:當流加培養基中只有酵母膏時,重組蛋白不穩定;而當流加培養基中只有蛋白胨時,大腸桿菌難以再利用其所產生的乙酸。若將酵母膏和蛋白胨同時加入流加培養基中,不但所生產的重組蛋白非常穩定,細胞還能再利用代謝合成的乙酸。
        無機氮源的選擇:(NH4)2HPO4為無機氮源時,(NH4)2HPO4自身含有的元素P可促進菌體生長。以(NH4)2SO4作為無機氮源時,S元素也可促進菌體生長。而硝酸鹽中的N原子不能被菌體直接利用,需要將其N原子還原成NH4+才能利用,在這一過程需要消耗一定的能量,因此菌體的生長受到了一定的限制,所以使用NaNO3或NH4NO3作為無機氮源時獲得的菌體量相對較少,不易實現高密度培養。
        高密度發酵中,微量元素的作用也是不容忽視的,某種微量元素的缺失可能造成菌體量的大幅減少甚至生長受阻。此外,如果所用的菌種在構建時進行了必要的基因敲除,有些物質(一般是維生素或氨基酸)無法自身合成,如生物素、硫胺素等就必須輔助性添加。
        無機鹽組分不僅用于維持細胞滲透壓或發酵環境pH穩定,其本身往往也參與到細胞代謝之中,如鎂離子是許多酶活性的中心,用法用量需要反復優化。
        此外,泡敵是對菌體生長明確有毒害作用的成分,在不影響消泡效果的前提下,有必要摸索其用量的下限作為使用濃度,以減少對菌體的損傷,尤其在種子培養階段。
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        發酵工藝:溶氧(DO)對微生物發酵的影響及其控制
        溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需,在發酵過程中受很多方面因素的影響。28℃時氧在發酵液中的飽和濃度只有7mg/L,比糖的溶解度小7000倍。高密度發酵中,菌體代謝強度大,溶氧需求量極高,對設備供氧能力要求也相應較高,DO往往成為生長代謝限制因素。為避免DO失控,DO設定值通常會處于較低的水平。由于DO電極校準時存在偏差或者電極老化檢測數據本身就不準確,很可能導致罐內缺氧時未被發及時發現。判斷發酵過程是否受氧的限制,最簡單的辦法是把培養溫度降低2~4度(不影響發酵前提下),根據溶氧濃度變化趨勢來了解氧的供需情況。如果降溫后DO迅速回升,說明目前供氧狀況良好;如果降溫后DO值并無回升響應,此時DO檢測值很可能屬于“假陽性”,說明罐內處于一定程度的缺氧狀態。
        培養液中的溶氧濃度的變化反映了菌體的生理狀況。通常在對數生長期DO明顯下降,從其下降的速率可估計菌的大致生長情況。DO低谷到來的遲早與低谷時的DO水平隨工藝和設備條件而異。二次生長時DO往往會從低谷處上升,到一定高度后又開始下降,這是利用第二種基質的表現。值得注意的是,在培養過程中并不是維持DO越高越好。即使是專性好氣菌,過高的DO對生長也可能不利。氧的有害作用是通過形成單線態氧、超氧化物基O2-、過氧化物基O22-或羥基自由基OH-,可破壞許多細胞組分。過氧化物基O22-或羥基自由基OH-,可破壞許多細胞組分。
        溶氧控制方法:
        在遵循先罐壓后攪拌再流量的調控順序原則上,改善溶氧的手段有以下幾種:
        ①在通氣中摻入純氧或富氧,使氧分壓提高;
        ②提高罐壓,能有效增加溶氧,但同時也會增加溶解CO2的濃度,因為它在水中的溶解度比氧高30倍。這會影響pH和菌的生理代謝,所以提高罐壓要控制在合理的范圍內,大腸桿菌發酵一般控制0.03~0.08MPa以內。
        ③改變通氣量,其作用是增加液體中夾持氣體體積的平均成分;在罐壓較大的情況下增加空氣流量,DO提高的效果顯著。但在罐壓較小的情況下提高空氣流量,對氧溶解度的提高不明顯,反而會使泡沫大量增加,導致逃液。大腸桿菌發酵常用通氣量為0.5~1.5VVM。
        ④提高設備的供氧能力,從改善攪拌考慮更容易收效。改變攪拌器直徑或攪拌槳葉角度可增加功率輸出。另外調整擋板的數目和位置,也可使剪切效果發生變化。比如四斜葉(萊寧A315攪拌槳)比其他槳葉能更有效地應用于高密度發酵中,并能顯著地減少功耗,在相同扭矩和功率下,四斜葉的傳質效率比Rushton槳葉高出30%。不同攪拌設計的溶氧分布效果差別非常大
        大腸桿菌發酵最適溫度是37 ℃,當溫度最適菌體生長時,比生長速率將會增大。隨溫度上升細菌代謝加快,其產生代謝副產物也會增加。這些副產物會對菌體的生長產生一定的抑制作用。菌體生長過快也會影響質粒的穩定性。降低培養溫度,菌體對營養物質的攝取和生長速率都會下降。同時也減少了有毒代謝副產物的產生和代謝熱的產生。有時降低溫度更有利于目的蛋白的正確折疊及表達。在重組大腸桿菌的發酵中不同發酵階段其最適溫度也不同,為了能獲得大量的目的蛋白,首先要保證菌體的量,因此在前期可優先考慮菌體的生長,到誘導階段應將目的產物的表達放在首位。大腸桿菌的不同克隆,誘導表達的溫度差異比較大,常用的有20度~32度,更高的誘導溫度意味著包涵體生成的概率成倍增加。
             發酵過程中培養液的pH值變化是微生物在一定環境條件下代謝活動的綜合指標,是發酵過程中重要參數,對微生物的生長和產物的積累有很大的影響。培養基中的碳/氮比不合適,碳源過多,特別是葡萄糖過量或者中間補糖過多或溶解氧不足,致使糖等物質的氧化不完全,培養液中有機酸大量積累,會導致pH下降;培養基中碳源缺乏,或培養基中的碳/氮比不當,氮源過多會使pH值上升。
        對于帶有誘導型啟動子的重組微生物,選取合理的誘導時機非常重要,一般的誘導時間選在指數生長后期,而且誘導時的比生長速率最好能控制在0.2之內。選在此時誘導,可將菌體的快速生長期與蛋白合成期分開,使這兩個階段互不影響,有利于蛋白的高表達。而且此時已經得到了一定量的菌體,從發酵動力學角度,以及能耗、物料成本方面,都比較合理。相較于誘導時機,誘導劑濃度并不那么重要,如果誘導時菌濃OD值在50以內,那么用0.1mM的IPTG進行誘導就足夠了。
        7大腸桿菌有氧代謝產乙酸有兩條途徑,分別為丙酮酸氧化酶路徑(poxB)和乙酸激酶/磷酸乙酰轉移酶路徑(ackA-pta)。發酵液中乙酸以HAc 和Ac-形式共存,HAc能滲透過細胞膜,在細胞內(pH約為7.5)再分解為H+和Ac-。由于不斷滲透使胞外HAc和Ac-之間平衡向HAc移動,結果引起一個凈電中性H+內流,降低了胞內pH 。細胞自身的穩態機制需要能量以改變胞內pH降低趨勢,從而破壞了跨膜質子梯度,而跨膜質子梯度是氧化磷酸化和其它跨膜運輸所必需。也有報道認為乙酸等短鏈脂肪酸對DNA、RNA、蛋白質、脂質和肽聚糖等的合成均有抑制,而這些大分子物質是菌體生長和外源蛋白表達所必需的。通過HPLC在210nm下或者酶聯反應在450nm下比色可以精確測定乙酸濃度。一般認為在好氣性條件下,5~10g/L 的乙酸濃度就能對比生長速率、菌體濃度以及后期蛋白收率等產生可觀測到的抑制作用。當培養液中乙酸濃度大于12g/L 時外源蛋白的表達完全被抑制,當乙酸濃度大于15g/L 時,細胞將會停止生長。
        8染菌一直是困擾整個發酵工業的難題。而在工程菌發酵中,相比于染菌問題,噬菌體污染更為常見。污染工程菌發酵的噬菌體包括烈性噬菌體和溫和噬菌體兩種。烈性噬菌體浸染菌體后能夠在宿主菌體內快速復制增殖,產生許多子代噬菌體,并最終裂解細菌,極短時間內就可使發酵液澄清化(菌體剛開始裂解會釋放核酸物質使發酵液變得粘稠,隨后逐漸澄清);溫和噬菌體感染宿主菌后并不馬上開始增殖。而是將其基因整合于細菌染色體上,隨細菌染色體的復制而復制,并隨細菌分裂而分配至子代細菌的染色體中,形成前噬菌體,這個過程稱為溫和噬菌體的溶原性生長周期。在某些理化或生物因素的誘導下,整合的前噬菌體脫離宿主菌染色體,產生新的子代噬菌體,并使宿主菌裂解,這個過程叫溶菌性生長周期。
        大腸桿菌浸染毒性噬菌體的鑒定
        1.配制培養基:
        LB液體培養基(1000ml水,10g蛋白胨:5g酵母粉:5g氯化鈉)、1.5%的固體培養基、0.7%的半固體培養基;
        2. 倒平板:將1.5%的固體培養基溶化,每個平板倒10-15ml的1.5%固體培養基,然后靜置至平板上沒有水珠為宜;
        3. 分裝0.7%的半固體培養基:將0.7%的半固體培養基加熱溶化,然后用5ml的移液槍向每個試管加入5ml的半固體培養基;試管的數量和上一步平板數是相同的;
        4. 等到試管中培養基溫度降至40℃左右時(不燙手),迅速向試管中加入100ul敏感菌和100ul的待測噬菌體液,搖勻;
        5. 將搖勻好的該培養基迅速倒入之前已倒有1.5%固體培養基平板中,晃動平板,使其鋪滿平板,靜置;
        6. 待所有平板倒好后,將其放入30℃恒溫箱中培養12h左右,即可觀察有無噬菌斑。
        8.2減少或避免噬菌體浸染的防范措施
        1. 從菌種構建開始,克隆菌種的感受態細胞及其它試劑要保證純凈沒有被污染;
        2. 發酵系統中的空氣系統要定期消毒并檢查;
        3. 發酵種子活化的環境要保持潔凈,并定期消毒;
        4. 發酵罐接種時要無菌操作,發酵過程取樣后的廢液要進行收集滅菌處理;
        5. 發酵過程的尾氣要通入吸收液處理后再排掉;
        6. 定期檢修發酵罐避免消毒死角的存在,發酵系統中的補料設施也要進行檢查;
        7. 發酵場所的地溝,排水池等要保持清潔,保證無活菌排放,并定期消毒;
        浸染噬菌體后的處理措施
        工程菌發酵浸染噬菌體還是以預防為主,一旦爆發后可通過以下措施進行處理:首先,通過雙層平板去排查是否是浸染了毒性噬菌體。若是溫和噬菌體則難以發現,會讓發酵過程間斷性的發生異常,此時可通過PCR等方法確認是否浸染了溫和噬菌體。其次,確定浸染噬菌體后,就要從菌種、培養基、發酵系統管路、地溝、污水池、菌種室等進行全面的消毒,通常需要物理和化學方式相結合。如下措施供參考:
        1. 暫停發酵生產工作,用紫外燈照射加甲醛熏蒸的方式對整個發酵場所進行消毒一個月;
        2. 對現有菌種庫做嚴格的噬菌體檢測,一旦發現污染痕跡,馬上和其它菌種隔離并進行滅活處理;
        3. 用甲醛、臭氧或二氧化氯熏蒸發酵小試間、菌種室等位置;
        4. 用化學消毒劑(譬如75%酒精、新潔爾滅、二氧化氯稀溶液等)清潔試驗臺、實驗室墻面和設備等表面;
        5. 一旦爆發噬菌體污染,停止任何形式的活菌排放,杜絕或盡量減少活菌開放性操作;
        6. 多點取樣進行噬菌體培養驗證,以檢驗滅活效果,直至無噬菌斑出現方可復產。
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