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        光合菌培養方法

        日期:2017-08-10 作者:上海聯環發酵罐 閱讀:249

        光合菌培養方法
        一、培養方式
        光合細菌的大量培養通常采用全封閉式厭氣光照培養發酵罐培養和開放式微氣光照培養發酵罐培養兩種方式。
            (一)全封閉式厭氣光照培養
            全封閉式厭氣光照培養是采用無色透明的玻璃容器發酵罐或塑料薄膜袋,消毒后裝入消毒好的培養液,接入20%~50%的菌種母液,使整個容器均被液體充滿,加蓋(或扎緊接口),
        造成厭氣的培養環境,置于有陽光的地方或用人工光源進行培養,定時攪動,在適宜的溫度下,一般經過5~10天的培養,即可達到指數生長期高峰,此時可采收或進一步擴大培養。
            (二)開放式微氣光照培養
            開放式微氣光照培養一般采用容量為l00~200升的塑料桶為培養容器(發酵罐)。在桶底部裝一氣石,培養時微充氣、使桶內的光合細菌呈上下緩慢翻動。在桶的正上方距捅面30厘米左有裝一有罩的白熾燈泡,使被面照度達2000 lx左右。培養前先把容器消毒,加入消毒好的培養液,接入20%~50%的菌種母液,照明,微充氣培養。在適宜的溫度下,一般經7~10天的培養,即可達到指數生長期高峰,此時,進行采收或進一步擴大培養。
            兩種培養方式相比,以厭氣培養方式較為理想,微氣培養方式雖然設備比較簡單,易于大量培養,但雜菌污染程度大,培養達到的菌細胞密度低。
            二、菌種分離、保藏
            培養光合細菌首先要有菌種。目前,應用于水產養殖業的光合細菌,主要是紅螺菌科即紫色非硫細菌中的一些種類。它們共同的特征是具鞭毛,能運動,不產生氣泡,細胞內不積累硫磺。光合細菌分離成功的關鍵在于選擇適宜的富集、分離培養基,和提供適于光合細菌生長需要的厭氣環境及適宜的溫度、光照條件。
            (一)采樣
            紅螺菌科細菌可用有機物作為光合作用的供氫體兼碳源,廣泛分布在被有機物污染的地方,如河底、湖底、海底、水田、溝渠和污水塘的泥土以及豆制品廠、淀粉廠和食品工業等廢水排水溝處呈橙黃色或粉紅色的泥土中。淺水處直接用杯舀取少量泥土作樣品,深水處借用采水器和采泥器采樣。
            (二)富集培養
            富集培養均采用液體培養基。將采回的樣品(土壤或水)裝入玻璃圓筒或大型試管或具塞的磨口玻璃瓶中,倒入配制好的培養液,充分攪拌。為造成厭氣環境,在玻璃圓筒或大型試管中加入液體石蠟以隔斷空氣。然后在溫度為25~35℃,光照為5000~10000 lx的條件下進行富集培養,經過2~8周的培養,在玻璃瓶壁上出現光合細菌菌落,或整個培養液長成紅色。如果培養的光合細菌是海水種,因其生長緩慢則需要更長的富集時間。    如果富集培養初步獲得成功,就用吸管插入菌液中或光合細菌大量繁殖的泥層中,將菌液吸入具塞的磨口玻璃瓶中,加入培養液繼續進行光照;厭氣培養。反復多次后,光合細菌壓倒其他細菌而占絕對優勢,培養液吳深紅色.這時富集培養成功。為了避免培養液中藻類和綠桿菌科細菌的生長繁殖,可用濾光片,使波長為800nm或更長波長的光透過,可以更有效地達到富集紫色非硫細菌的目的。
        此外,培養紫色非硫細菌時,用含氯化物的培養基比用合硫酸鹽的培養基效果好。
        (三)分離方法
        富集培養成功后可進行分離培養。淡水生長的紫色非硫細菌生長速度較快,在1周左右移植比較合適,而海水生長的紫色非硫細菌生長速度較慢,培養3周以上才能移植。先配制固體培養基,滅菌后澆成平板。將富集培養成功的菌液適當稀釋,在平板劃線,然后在厭氣、光照條件下培養。培養溫度為25~35℃,光照為2000~3000 lx,培養2~7天左右,就能長出光合細菌菌落。仔細挑取單菌落,繼續用上述方法分離培養。反復多次,便能得到紫色非硫細菌的純培養物。
        三、培養方法
        光合細菌的培養,按次序分為容器(光照發酵罐)、工具的消毒,培養基的制備,接種和培養管理四個步驟。
        (一)容器、工具的消毒
            參考微藻培養方法部分。
            (二)培養基的制備
            1.培養用水
            如果培養的光合細菌是淡水種,菌種培養可用蒸餾水,生產培養可用消毒的自來水(或井水)配制。如果培養的光合細菌是海水種,則用天然海水配制培養基,注意在海水中加入磷元素時,不能用磷酸氫二鉀,應用磷酸二氫鉀,不然會產生大量沉淀。
            2.滅菌和消毒
            菌種培養用的培養基應連同培養容器(光照發酵罐)用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌。小型生產性培養可把配好的培養液用普通鋁鍋或大型三角燒瓶煮沸消毒。大型生產性培養則把經沉淀砂濾后的水用漂白粉(或漂白液)消毒后使用(具體方法參考微藻培養方法部分)。
            3.培養基配制
            根據所培養種類的營養需要選擇合適的培養基配方。按培養基配方把所需物質稱量,逐一溶解,混合,配成培養基。也可先配成母液,使用時按比例加入一定的量即可。
            (三)接種
            培養基配好后,應立即進行接種。光合細菌生產性培養的按種量比較高,一般為20%~50%,即菌種母液量和新配培養液雖之比為1∶4~1∶1,不應低于20%,尤其是微氣培養,接種量更應高些,否則光合細菌在培養液中很難占絕對優勢,影響培養的最終產量和質量。
            (四)培養管理
            光合細菌的培養過程中,管理工作包括日常管理操作和測試,生長情況的觀察、檢查以及出現問題的分析處理等三個方面。
            1.日常管理和測試
            (1)攪拌和充氣:光合細菌培養過程中必須充氣或攪拌,作用是幫助沉淀的光合細菌上浮獲得光照,保持菌細胞的良好生長。
            小型厭氣培養常用人工搖動培養容器的方法使菌細胞上浮,每天至少搖動三次,定時進行。大型厭氣培養則用機械攪拌器或使用小水泵使水緩慢循環運轉,保持菌體懸浮。微氣培養是通過充氣幫助菌體上浮,因為培養液中溶解氧含量增加,光合細菌繁殖受到抑制,產量下降,所以必須嚴格控制充氣量。一般采用定時斷續充氣,充氣量控制在1~1.5升/之間,溶解氧量保持在1×10-6以下。
            (2)調節光照度:培養光合細菌需要連續進行照明。在日常管理工作中,應根據需要經常調整光照度。白天可利用太陽光培養,晚上則需要人工光源照明,或完全利用人工光源培養。人工光源一般使用碘鎢燈或白熾燈泡。不同的培養方式所要求的光照強度有所不同。一般培養光照強度應控制在2000~5000 lx之間。如果光合細菌生長繁殖快,細胞密度高,則光照強度應提高到5000~10000 lx。光照強度可通過調整培養容器與光源的距離或使用可控電源箱調節。
            (3)調節溫度:光合細菌對溫度的適應范圍很廣,一船在23~39℃的范圍內均能正常生長繁殖,可不必調整溫度。在常溫下培養也可通過調整,將溫度控制在光合細菌生長繁殖最適宜的范圍內,使光合細菌更好地生長。
            (4)酸堿度的測定和調整:在培養光合細菌的過程中,必須注意酸堿度的變化。由于光合細菌的大量繁殖,菌液的pH值上升,這意味著光合細菌正處于指數生長期。但當pH值超過最適范圍甚至生長的適應范圍時,光合細菌的生長達到頂點,隨后生長下降。如果能及時調整菌液的酸堿度,使pH值保持在最適范圍,則光合細菌能繼續生長繁殖。為了延長光合細菌的指數生長期,提高培養基的利用率和單位水體的產量,測定和調整PH值是非常重要的。一船采用加酸的辦法來降低菌液的酸堿度,醋酸、乳酸和鹽酸部可使用,最常用的是醋酸。
            在日常的管理工作中,必須每天或隔天測定菌液的pH值,當pH值上升超出最適范圍,即加酸調整。如果在培養過程中不測定、調整酸堿度,當光合細菌的生長達到一定密度后pH值也上升到9以上,細菌生長受阻,此時應采收或再擴大培養。在培養過程中不調整PH值,獲得的最終產量低。
            2.生長情況的觀察和檢查
            光合細菌生長情況的好壞是培養成敗的標準。在培養過程中,可以通過觀察菌液的顏色及其變化來了解光合細菌生長繁殖的大體情況,菌液的顏色是否正常,接種后顏色是否由淺變深,均反映光合細菌是否正常生長繁殖以及繁殖速度的快慢。必要時可通過顯微鏡檢查,了解情況。
            3.問題的分析和處理
        通過日常管理、檢測、檢查,了解光合細菌的生長情況,就可以結合當時環境條件的變化進行分析,找出影響光合細菌生長繁殖的原因,采取相應的措施。影響光合細菌生長的原因很多,內因是菌種是否優良,外因是光照、溫度、營養、敵害和厭氣程度等。溫度、光照和pH值都能影響著光合細菌的生長,而且溫度、光照和pH值之間是互相制約的,溫度與光照的強弱是對立統一的,所以光合細菌生長的最適條件應是互應的,即溫度高,光照應弱;溫度低,光照應強。如果是溫度高,光照強,pH值就會迅速升高,培養基產生沉淀,抑制光臺細菌的生長;如果溫度低,光照弱,光合細菌得不到最佳能源,生長速度也慢。經試驗得出光合細菌生長的最適條件是:①溫度15~20℃時,光照30000~50000 lx,培養基pH值為7.0;②溫度25~30℃時,光照為3000~5000 lx,培養基的pH值為7.0。

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